直播答疑 | 三大難養細胞培養解析

6月29日，普諾賽就 RAW 264.7、SF9、NK-92這三個細胞進行了一場直播分享，分別詳細講解了三株細胞的培養方法及需要注意的問題。直播回放可以點擊普諾賽公眾號菜單欄【資料中心】-【往期直播回放】查看學習。本期直播答疑，從直播間的提問中，篩選出其中有代表性的問題，逐一進行解答。

01

RAW 264.7細胞傳代方法：

①　培養基中的漂浮的細胞離心收集

②　輕拍培養瓶，將貼壁松散的細胞拍起來

③　用1ml的槍把貼壁的細胞吹下來

④　將細胞懸液轉移到15ml離心管

⑤　1200rpm 離心3min

⑥　去上清，用新鮮培養基重懸細胞

⑦　加入培養皿中（建議用培養皿，方便吹打）

需要觀察下細胞的增殖速度，細胞是否是聚團漂浮，如果細胞增殖且聚團漂浮的話，證明細胞活力是可以的。可以嘗試將漂浮細胞收集，吹散成單顆，測細胞的數量和活力，培養傳代時活細胞密度保持在1-1.5*10⁵/mL，多傳幾次，細胞就會貼壁展開了。

03

文章中有關RAW264.7細胞在進行M2 型誘導時有的加 IL-4（20 ng/ml）或者 IL4+IL13 誘導、仿生層狀殼聚糖支架（LCS），WB/QPCR 檢測。主要是看相關指標檢測結果（MR(CD206),ArgI 高表達），極化時間需要參考文獻，最好是做下預實驗，摸索下濃度和時間。

04

細胞生長形態以圓形為主，存在梭形狀態，此時細胞依舊處于分化程度較低的狀態；細胞形態不規則，多觸角狀態時分化程度較高，貼壁牢固，強行吹打或細胞刮取不當會導致細胞進一步分化，傳代時可選擇只收集能夠輕輕吹打下來的圓形細胞，這部分細胞分化程度最-低，狀態最佳，同時更換新的培養容器，可以每天將圓形細胞輕輕吹下來。

05

細胞倍增時間是12-30h，本身生長速度快，若是不想頻繁傳代，可以嘗試擴大細胞的傳代比例，降低培養基中的血清含量。

06

細胞生長時聚集的細胞團會逐漸增大，正常的細胞團顯微鏡下為白色透亮的細胞團，若細胞聚團比較多，100倍鏡下有6-8個大的細胞團可傳代。

傳代方法：將培養瓶輕輕晃幾下，或者用移液器輕輕吹散（一般吹2-3次即可），吹打力度不可過大，不要全部吹散，否則會出現大量死細胞和細胞碎片。均分到兩個瓶子里，每瓶再補充等量培養基；

細胞對營養要求也很高，不能團塊過大大導致營養不足。

07

細胞團過大時，鏡下觀察團中部會發暗，中間的細胞會接觸不到營養，可以用槍頭輕輕吹1-2下，吹打力度不能太大，將團吹小，不要全部吹散。

08

NK-92細胞平常培養時是會有細胞碎片的，若是有大量碎片，可以一周低速離心一次（800rpm，3min），去除部分死細胞和細胞碎片。

09

NK-92細胞培養過程中死細胞和細胞碎片都懸浮在培養基中，培養過程中不會完-全沒有死細胞和細胞碎片，且細胞聚團懸浮，平常將細胞吹散成單顆測活力時，也會導致部分細胞損傷，所以活率在80-90%是正常的范圍。

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馴化前細胞活率要比較高，能夠達到90%以上，馴化過程需要把握好細胞的密度，避免接種密度過低，導致生長速度慢，若是有碎片可以采用800轉離心去除。

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可以采用Cellfectin® II 試劑，是一種陽離子脂質制劑，設計用于昆蟲細胞的極-佳轉染；PEI MAX也可用于轉染，轉染時可篩選出合適轉染培養基，有利于轉染效率。

一般會加一個GFP的對照質粒，3-4天后可觀察是否有熒光反應，昆蟲細胞轉染后約5-7天后，大部分細胞變大病變，出現裂解的現象。

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首先要確認下黑點是什么污染，如果是細菌污染，污染物（黑點）較少，細胞形態和生長速度未收到影響時可以嘗試5%雙抗洗滌2遍，培養基中加大雙抗比例，去除污染；如果不是細菌污染，加雙抗是沒有效果的，需要注意消化時間的把握，傳代過程盡量少吹打。

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支原體污染的細胞一般表現為細胞背景臟，背景有大量細胞碎片，細胞生長速度也可能受到影響，具體是否是支原體污染需要進行進一步檢測，單憑顯微鏡觀察并不能確定是支原體污染。